Husniati1), Muhammad Hanafi2)
Baristand Industri Bandar Lampung1), Pusat Penelitian Kimia LIPI – Puspiptek, Serpong2), husniati.eni@gmail.com
ABSTRAK
Senyawa analog UK-3A baru yang didefinisikan sebagai 2-Hidroksi-N-oktilbenzamida berhasil disintesis dari reaksi amidasi asam karboksilat aromatik dan amina primer dengan menambahkan aktivator DCC (N,N’-disikloheksilkarbodiimida), katalisator DMAP (4-dimetil amino piridin), dan kloroform sebagai pelarut sebanyak 5 mL. Reaksi berlangsung dalam alat dean-stark dengan pengadukan tetap pada suhu 60 0C selama 24 jam. Melalui reaksi tersebut diperoleh rendemen sebanyak 93%. Struktur senyawa ini diidentifikasi menggunakan UV, FT-IR, 1H-NMR, dan 13C-NMR. Bioaktivitas senyawa diuji secara in vitro terhadap sel kanker Murine leukemia P-388 menggunakan metode MTT (3-(4,5-dimetiltiazo-2-il-)2,5-difeniltetrazolium bromide. Hasil bioassay menunjukkan bahwa senyawa tersebut dapat menghambat pertumbuhan sel kanker dengan aktivitas lebih tinggi dari pada senyawa induk yang ditunjukkan dari nilai IC50 (inhibitory concentration). Analog UK-3A mempunyai IC50=7,5mg/mL sedangkan UK-3A induk =38mg/mL.
Kata kunci: UK-3A, analog UK-3A, Antikanker, P-388.
ABSTRACT
The novel compound of analog UK-3A defined as 2-hydroxy-N-octylbenzamide was successfully synthesized by the amidation reaction of aromatic carboxylic acids and primary amine by adding the activator of DCC (N, N’-dicyclohexylcarbodiimide), catalyst DMAP (4-dimethyl amino pyridine), and chloroform as a solvent (5 mL). The reaction held in the dean-stark device with continue stirring at 60 0C for 24 hours. Result shows yield as much as 93%. The structure was identified using UV, FT-IR, 1H-NMR, and 13C-NMR. Bioactivity of the compound was tested in vitro against murine leukemia cancer cells P-388 by using the MTT (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. The result of bioassay showed that this analog compound can inhibit the growth of cancer cell Murine leukemia P-388 with a higher activity than UK-3A indicated by the value of IC50 (inhibitory concentration). IC50 of analog UK-3A was found 7,5 mg/mL whereas IC50 for UK-3A was 38 mg/mL.
Keywords : UK-3A, analog UK-3A, anticancer, P-388.
PENDAHULUAN
UK-3A telah diisolasi dari Streptomyces sp. 517-02 sebagai komponen minor. (1,2,3) Senyawa UK-3A ini memiliki aktivitas penghambatan yang tinggi terhadap pertumbuhan jamur, bakteri, dan sel kanker. (2,3,4-7) Aktivitas antikanker dari senyawa antibiotika UK-3A telah terbukti memiliki daya sitotoksik terhadap pertumbuhan sel kanker Murine leukemia P388 dimana nilai IC50 sebesar 38 µg/mL secara in-vitro. (4,5) Senyawa UK-3A memiliki kemiripan struktur dengan senyawa Antimisin A3 yang telah dikenal sebagai antibiotika dan bekerja sebagai inhibitor rantai respirasi mitokondria sehingga tidak terjadi konversi energi untuk kelangsungan hidupnya. (8) Kedua struktur ditunjukkan pada Gambar 1.
 |
| Gambar 1. Struktur molekul UK-3A dan kemiripan struktur terhadap antimisin A3 |
Sintesis senyawa UK-3A memerlukan beberapa bahan baku dengan rute reaksi yang cukup panjang sehingga memerlukan pembiayaan yang kurang ekonomis. (9) Untuk memperoleh senyawa analog UK-3A dilakukan suatu rancangan dalam struktur UK-3A dengan cara teknik modifikasi gugus fungsi.
Patrick, 2001, mendefinisikan senyawa analog yaitu senyawa yang dibuat berdasarkan senyawa induk yang telah ditemukan mempunyai aktivitas biologi. Ada dua alasan penting disintesisnya senyawa analog ini adalah sebagai studi identifikasi gugus fungsi yang penting dalam menjelaskan mekanisme pengikatan senyawa induk dengan targetnya serta mempunyai keuntungan dalam pengembangan obat bahwa aktivitas senyawa induk dapat diperbaiki dan mengurangi munculnya efek samping. Sintesis senyawa analog mempunyai tahapan reaksi seminimal mungkin dan menggunakan bermacam-macam reaktan sehingga sebanyak mungkin senyawa analog berbeda dapat disintesis. (10)
Hasil sintesis senyawa analog dari modifikasi gugus aktif diharapkan mempunyai aktivitas biologi serupa, lebih rendah, atau lebih tinggi dari senyawa induk. (9,10) Peranan gugus aktif hidroksil, amida, dan dilakton cincin sembilan dalam UK-3A mempunyai pengaruh terhadap daya sitotoksik sel kanker P-388.
Beberapa penelitian telah memberikan hasil uji dari pengaruh gugus aktif -OH dan CONH (4,5,11) dan dilakton cincin sembilan terhadap aktivitas anti kanker. Bila dilakton cincin sembilan terhidrolisis oleh asam/basa menghasilkan senyawa seperti pada Gambar 2 yaitu 3-hidroksipikoliin serin metil ester (A) dan ester lakton cincin lima (B). Kedua senyawa A dan B tidak mempunyai aktivitas anti kanker terutama P388 yang sebelumnya ada pada senyawa induk, UK-3A.(12) Suatu senyawa tidak memperlihatkan aktivitas biologisnya pada konsentrasi di atas 100 mg/mL. (6)
 |
| Gambar 2. Struktur hidrolisis molekul UK-3A, 3-hidroksipikoliin serin metil ester (A) dan ester lakton cincin lima (B). |
Aktivitas senyawa A dilakton cincin terbuka dapat ditingkatkan dengan cara esterifikasi senyawa asam karboksilat seperti PSMOE (3-hidroksi pikolinin serin metil oktil ester) memberikan nilai IC50 sel kanker P-388 adalah 15,4 mg/ml lebih tinggi dari aktivitas antikanker UK-3A. (12)
Pada makalah ini akan dilaporkan hasil sintesis senyawa analog UK-3A dan uji bioaktivitasnya. Sintesis senyawa analog dilakukan dengan cara menghilangkan gugus dilakton rantai terbuka sehingga senyawa analog baru menjadi lebih sederhana karena hanya merupakan satu reaksi amidasi. Senyawa analog baru tetap mempertahankan gugus-gugus aktif OH (hidroksil) dan CONH (amida).
BAHAN dan METODE
Bahan baku sintesis : 0,276 g asam salisilat (E. Merck); 0,364 mL oktilamin (E. Merck); 0,454 g DCC (N,N-disikloheksil karbodiimida) (Sigma); 0,269 g DMAP (N,N-4-dimetil amino piridin) (Sigma) dan 5mL pelarut kloroform (E. Merck).
Bahan proses pemurnian : filtrat yang diperoleh diekstraksi dengan 25 mL CHCl3 (teknis) kemudian dilewatkan dalam kolom kromatografi silika gel (E. Merck) menggunakan eluen 4:1 n-heksana : etil asetat (teknis).
Bahan uji sitotoksik : Reagen MTT [3-(4,5-dimetilthiazol-2-il)-2,5-difenil tetra zolium bromida]; Fetal Bovine Serum (FBS); penisilin; streptomisin; Kultur sel kanker Murine leukemia P388; DMSO (dimetil sulfoksida); PBS (phosphoric buffer solution); cis-platin; SDS (sodium dodesil sulfat).
Alat
Identifikasi kromofor menggunakan alat UV dengan kisaran panjang gelombang, l= 200-400 nm dengan konsentrasi 1000 ppm dalam pelarut metanol. Analisis gugus fungsi menggunakan FT-IR. Serapan sampel padatan yang digerus bersama KBr kemudian dibentuk menjadi cakram tipis dan serapannya diukur pada daerah infra merah dengan panjang gelombang, l= 15,4-2,5 mm (650-4000 cm-1). Konfirmasi struktur lebih lanjut ditentukan dengan 1H-NMR dan 13C-NMR.
Metode
Sintesis :
Bahan baku dari 0,276 g asam salisilat (E. Merck); 0,364 mL oktilamin (E. Merck); 0,454 g DCC (N,N-disikloheksil karbodiimida) (Wako); 0,269 g DMAP (N,N-4-dimetil amino piridin) dan 5mL pelarut kloroform direaksikan selama 24 jam pada suhu 60 0C dalam alat dean-stark berukuran 200mL sambil dilakukan pengadukan secara terus menerus menggunakan pengaduk magnet dan hot plate stirrer.
Reaksi pembentukan senyawa 2-Hidroksi-N-oktilbenzamida disertakan dengan pembentukan produk samping DCU (disikloheksil urea). Kelebihan DCC dihilangkan dengan penambahan air sedangkan DCU dipisahkan melalui penyaringan. Kemudian filtrat diekstraksi dengan 25mL kloroform. Air yang terbawa dalam pelarut organik dihilangkan dengan penambahan magnesium sulfat anhidrat hingga jenuh. Sampel dikeringkan dari pelarutnya dengan penguapan menggunakan evaporator vakum pada 50 0C. Sampel dimasukkan ke dalam kolom kromatografi yang berisi silika gel dan dielusi dengan gradien konsentrasi n-heksan:etil asetat mulai dari 100% hingga 50% n-heksan.
Fraksi yang menunjukkan spot tunggal (fraksi murni) dari produk yang diinginkan selanjutnya dikarakterisasi secara kualitatif menggunakan KLT (E. Merck) dan diamati menggunakan lampu UV pada l= 254 dan 360 nm. Identifikasi struktur molekulnya juga dianalisis menggunakan instrumentasi UV, FT-IR, NMR. Aktivitas biologi senyawa sintesis diuji menggunakan sel kanker Murine leukemia P 388 secara in vitro. (13)
Uji Bioaktivitas antikanker secara invitro
Kultur sel kanker Murine leukemia P388 sejumlah 3 x 103 sel/mL disuspensikan ke dalam media RPMI 1640 yang telah mengandung FBS (Fetal Bovine Serum), penisilin dan streptomisin. Sel pada hari pertama diinokulasikan ke dalam microplate 96 well plate dan diinkubasi dalam inkubator CO2. Hari kedua dilakukan penambahan sampel yang dilarutkan dalam pelarut DMSO (dimetil sulfoksida). Sampel dengan konsentrasi beragam diencerkan dengan penambahan PBS (phosphoric buffer solution) dengan pH (7,30–7,65) ditambahkan ke dalam sel dalam microplate lalu dikocok dan disimpan kembali dalam inkubator CO2. Kontrol negatif terhadap aktivitas antikanker digunakan pelarut DMSO sedangkan kontrol positif digunakan senyawa standar cis-platin. Setelah 48 jam, ke dalam sel ditambahkan reagen MTT dan diinkubasi selama 4 jam untuk selanjutnya ditambahkan SDS dan dikocok dengan baik. Inkubasi sel dilanjutkan kembali selama 24 jam. Perubahan warna dari MTT kuning menjadi formazan ungu di dalam mitokondria sel yang masih hidup dapat dikuantifikasi pada panjang gelombang λ=550 nm dengan spektrofotometer. Nilai IC50 dilihat dari grafik hubungan antara konsentrasi senyawa bahan uji (mg/mL) dengan intensitas larutan dari viabilitas sel. (14)
HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Sintesis senyawa Analog 2-Hidroksi-N-oktilbenzamida
Mekanisme reaksi sintetis senyawa analog 2-Hidroksi-N-oktilbenzamida mengikuti mengikuti persamaan reaksi yang ditunjukkan pada Gambar 3.
 |
| Gambar 3. Mekanisme reaksi pembentukan |
Senyawa analog 2-Hidroksi-N-oktilbenzamida telah disintesis secara optimal menggunakan bahan baku asam karboksilat aromatik dan amina primer, aktifator DCC, katalis DMAP dan pelarut kloroform secara bersamaan direaksikan selama 24 jam pada suhu 60 0C dalam alat dean-stark sambil dilakukan pengadukan secara terus menerus. Reaksi pembentukan senyawa disertakan dengan pembentukan produk samping DCU (disikloheksil urea) yang dapat dihilangkan melalui penyaringan.
Penggunaan secara bersamaan katalis dan aktifator memberikan rendemen produk lebih tinggi dan reaksi berlangsung pada suhu tidak terlalu tinggi. (15) Melalui reaksi tersebut dihasilkan rendemen sebanyak 93% dengan spesifikasi senyawa berbentuk kristal jarum berwarna putih dengan titik leleh 43-45 0C.
Untuk analisis produk dilakukan identifikasi adanya kromofor dalam struktur molekulnya menggunakan UV. Kurva absorbsi memberikan serapan maksimal pada titik tertinggi kurva dengan lmax= 246, 298,5 dan 324nm. Absorbsi tersebut terjadi karena transisi p p* ditandai munculnya 3 puncak berasal dari sistem aromatik.
Analisis produk untuk penentuan gugus fungsi dilakukan menggunakan FT-IR. Hasil analisis ditunjukkan seperti pada Tabel 1.
Tabel 1. Daftar daerah spektrum gugus fungsi senyawa
Ikatan | Daerah absorbsi (u cm-1) |
C=O N-H dan O-H C-H alifatik C-H aril C=C aril | 1641 3344 2850-2954 3223 1442-1583 |
Berdasarkan penafsiran spektrum IR maka senyawa yang telah terbentuk ditemukannya gugus fungsi C=O dan NH amida, C-H alifatik, C-H aromatik, dan O-H.
Konfirmasi lebih lanjut terhadap struktur molekul untuk produk yang diperoleh mengunakan analisis spektrum 1H-NMR dan 13C-NMR. Hal ini dilakukan untuk mengatasi problema penentuan struktur suatu senyawa hanya melalui informasi gugus fungsi saja. Informasi pengukuran dari spektrum 1H-NMR dapat memberikan deskripsi mengenai bagian hidrokarbon molekul dari nilai pergeseran kimia yang menunjukkan proton untuk masing-masing lingkungan kimia, konstanta kopling (J), dan jumlah proton dari hasil integrasinya. Pengukuran dari spektrum 13C-NMR dapat diketahui jenis karbon primer, sekunder, tersier dan kuartener (-CH3, -CH2-, CH-, -C-, O-C, C=O, -CONH-, dan lain-lain) (16). Lihat Gambar 4. Data prgeseran kimia pada Tabel 2.
C/H | Pergeseran Kimia (d, ppm) | |
1H-NMR(m*,J dalam Hz) | 13C-NMR | |
1-CON- 2 3-C-OH 4 5 6 7 1’ 2’ 3’-7’ 8’ NH | - - 12,43 (1H, s) 6,81(1H, m) 7,36(1H, m) 6,96(1H, m) 7,37(1H, m) 3,42 (2H, q) 1,60 (2H, m) 1,27 (10H, m) 0,87 (3H, t, 7,35) 6,48(1H, d, 4,75) | 170,10 114,56 161,00 118,67 134,20 118,75 125,47 39,40 31,90 29,37 14,21 - |
2. Bioaktivitas antikanker
Uji bioaktivitas senyawa analog UK-3A terhadap sel kanker seperti terlihat pada Tabel 3 di bawah ini.
 |
Gambar 4. Spektrum 1H-NMR dan 13C-NMR |
Tabel 3. Hasil uji senyawa analog UK-3A terhadap sel kanker Murine leukemia P388
No. | Senyawa | IC50 (mg/mL) |
1 2 3 | 2-Hidroksi-N-oktilbenzamida cis-platin UK-3A | 7,5 12 38 |
Berdasarkan tabel di atas, senyawa analog 2-Hidroksi-N-oktilbenzamida mempunyai aktivitas antikanker leukemia P388 lebih tinggi jika dibandingkan dengan senyawa induk, UK-3A. Keuntungan senyawa analog yang disintesis ini diperoleh berdasarkan modifikasi struktur molekul senyawa UK-3A induk dengan satu tahap reaksi amida dan mempunyai aktivitas biologi lebih unggul. Aktivitas anti kanker ditunjukkan oleh nilai IC50 yang lebih rendah karena IC50 adalah nilai penghambatan pertumbuhan sel kanker sebesar 50%.
Aktivitas senyawa ditunjukkan dari struktur molekul salisilat/fenol. Gugus fenol yang ada pada senyawa analog diperkirakan mempunyai peranan penting dalam aktivitas. Gugus OH pada senyawa diduga mempunyai interaksi pengikatan senyawa pada sisi pengikatan (binding site) sel target melalui ikatan hidrogen yang terlibat antara dua molekul yang bekerja sebagai donor dan akseptor. Donor ikatan hidrogen adalah proton dari fenol yang menempel pada atom oksigen yang bersifat elektronegatif dan sebagai akseptornya adalah gugus-gugus OH yang ada pada sel target/reseptor. (10)
Pengaruh gugus hidrokarbon netral dari senyawa ini yang memiliki gugus alkil mempunyai kemampuan untuk cocok/tepat ke dalam kantong hidropobik (hydrophobic pocket) dengan interaksi van der Waals Interaksi tersebut penting untuk pengikatan molekul obat dengan binding site sel. (10)
KESIMPULAN
Senyawa analog UK-3A, 2-hidroksi-N-oktilbenzamida, disintesis dari asam salisilat dan oktilamina dengan rute reaksi lebih sederhana dan diperoleh rendemen baik sebanyak 93%.
Spesifikasi senyawa analog tersebut berbentuk kristal jarum berwarna putih dengan titik leleh 43-450C.
Aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker Murine Leukemia P388 memberikan hasil uji IC50 = 7,5 mg/mL. Senyawa analog UK-3A tersebut mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker Murine Leukemia P388 lebih tinggi dibandingkan senyawa induk, UK-3A dengan IC50 = 38 mg/mL.
UCAPAN TERIMAKASIH
Terima kasih atas bantuan dana penelitian kepada Badan Penelitian dan Pengembangan Industri dan Pusat Pendidikan dan Pelatihan Departemen Perindustrian.
DAFTAR ACUAN
1. Ueki, M., Hanafi, M., Shibata, K., and Taniguchi, M. 1996. “UK-3A a novel antifungal antibiotics from Streptomyces sp. 517-02, fermentation, isolation, and biological properties”, J. Antibiotic, 49 : 639-644.
2. Taniguchi, M., Shibata, K., Abe, K., Kodama, R., and Uotani, K. 1995. Jpn. Patent, 7-233165.
3. 3. Ueki, M., Hanafi, M., Shibata, K., and Taniguchi, M. 1996. “UK-2A, B, C and D novel antifungal antibiotics from Streptomyces sp. 517-02”, structure elucidation. J. Antibiotics, 49: 1226-1231.
4. Hanafi, M., Shibata, K., Ueki, M., and Taniguchi, M. 1996. “UK-2A, B, C, and D: a novel antifungal antibiotics from Streptomyces sp. 517-02 : II. Structural elucidation”, J. Antibiotics, 49 (12): 1226-1226.
5. Ueki, M., Kusumoto, A., Hanafi, M., Shibata, K., Tanaka, T., and Taniguchi, M. 1997a. “UK-3A a novel antifungal antibiotics from Streptomyces sp. 517-02, fermentation, isolation, structure elucidation and biological properties”, J. Antibiotic, 50 (7) : 551-555.
6. Ueki, M. and Taniguchi, M. 1997b. “The mode of action of UK-2A and UK-3A novel antifungal from Streptomyces sp. 517-02”, J. Antibiotic, 50 (12): 1052-1057.
7. Shimono, M., Kamei, N., Shibata, T., Inoguchi, K., Itoh, N., Ikari, T., and Senda, H. 1998. “Total synthesis of the antifungal dilactones UK-2A and UK3A: The determination of their relative and absolute configurations, analog synhesis and antifungal activities”. Tetrahedron, 54:12745-12774
8. Shiomi, K., Hatae, K., Hatano, H., Matsumono, A., Takahashi, Y., Lin Jiang, C., Tomoda, H., Kobayashi, S., Tanaka, H., and Omura, S. 2005. “A new antibiotic, antimycin A9, produced by Streptomyces sp. K01-0031”. J. Antibiot., 58 (1): 74-78
9. Usuki Y., Adachi N., Fujita K., Ichimura A., Iio H., and Taniguchi, M. 2006. “Structure Activity Relationship Studies on UK-2A, a Novel Antifungal Antiniotic from Streptomyces sp. 517-02. Part 5: Roles of the 9-Membered Dilactone-Ring Moiety in Respiratory Inhibition”. J. Bioorganic and Medicinial Chemistry Letter, 16: 3319-3322.
10. Hanafi, M. 1995. “Studies of novel antibiotics metabolites from Streptomyces sp. 517-02”. Thesis Departemen of Chemistry Faculty of Science. Osaka City University. Osaka.
11. Patrick, G. 2001. “Instant notes in medicinal chemistry”, BIOS Scientific Publisher.
12. Hanafi, M dan Thelma, A. B. 1998. ”Sintesis senyawa analog antibiotika UK-3, pengaruh gugus hidroksi terhadap aktivitas biologi”. Prosiding Seminar Nasional II Kimia dalam Pembangunan, Holiday Inn. Yogyakarta.
13. Hanafi, M., Anita, Y., dan Putra, A. M. J. 2008. “Sintesis pengaruh lipofilisitas pada analog UK-3A terhadap aktivitas antikanker leukemia P-388”. Seminar IPT. LIPI. Serpong
14. Husniati, 2008. ”Sintesis senyawa analog UK-3A: 3-hidroksi-N-oktilpikolinamida, 2-hidroksi-N-fenil-benzamida, 3-hidroksi-N-fenilpikolinamida, dan 2-hidroksi-N-oktilbenzamida, dan uji bioaktivitas secara in-vitro terhadap sel kanker murine leukemia P-388”, Tesis, Magister Sains Ilmu Kimia, Program Pascasarjana U.I, Depok.
15. Sahidin., 2005. “Cytotoxic properties of oligostilbenoids from the tree barks of hopea dryobalanoides”, J. Naturforsch, 60: 723-727.
16. Akitt, J. W. 1983. “An introduction to the fourier transform-multinuclear era”, 2nd ed., Chapman & Hall Ltd., New York, USA.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar